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    技術(shù)干貨:一文讀懂菌液OD600測量

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        微生物和細(xì)胞生長的光密度(OD)測量是微生物學(xué)及生物發(fā)酵實驗室中最常用的方法之一,用于在進行蛋白表達(dá)或監(jiān)測培養(yǎng)過程時確定收獲的最佳時間。細(xì)胞、細(xì)菌或酵母在液體培養(yǎng)基中的生長情況(細(xì)胞密度、細(xì)菌生長、酵母生長)通常通過測量600nm下的光密度(OD600)來獲得。OD600測量通常用于確定細(xì)菌培養(yǎng)物的生長階段,這些測量有助于確保在適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度下收獲細(xì)胞。

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        由于OD600測量的光密度是由光散射而非光吸收引起的,因此細(xì)胞的大小和形狀以及死細(xì)胞和碎片可能會增加光散射。因此,當(dāng)在相同的儀器上測量時,處于相同密度水平(如Cells/mL)的不同細(xì)胞類型可能顯示出不同的OD600值。

        細(xì)菌細(xì)胞的生長通常經(jīng)歷一系列連續(xù)的階段,包括滯后、對數(shù)、靜止和衰退。通常,應(yīng)在對數(shù)期結(jié)束時收獲細(xì)胞,使用樣品的光密度OD600來確定何時達(dá)到這一時間點,是非常便捷的。在誘導(dǎo)或收獲之前,細(xì)胞通常常規(guī)生長至OD600達(dá)到約0.4。

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    朗伯-比爾定律與OD600


        朗伯-比爾定律,根據(jù)經(jīng)驗將光的吸收與樣品的濃度聯(lián)系起來。該定律表明,光通過特定樣品的透射率(T=I/Io,其中I=出射光,Io=入射光)、特定化合物的消光系數(shù)(ε)、樣品中具有光吸收的物質(zhì)的濃度(c)和光傳播的距離(d)之間存在對數(shù)關(guān)系。根據(jù)朗伯-比爾特定律,OD值與細(xì)菌濃度(C)或數(shù)量(N)具有類似的定義。然而,OD600的測量實際上是濁度的測量,因此,我們可以應(yīng)用朗伯-比爾定律定律,但需要進行一些額外的考量,如樣品濁度(濃度)的適用范圍,設(shè)備收集非散射光的結(jié)構(gòu)等。


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    OD600讀數(shù)的差異


        對于混濁的樣品,如細(xì)胞培養(yǎng)物,測量的吸光度的主要來源于光散射,而不是完全遵循朗伯-比爾定律中的分子吸收的原理。因此,測量取決于分光光度計的光學(xué)設(shè)置(比色皿和儀器出射狹縫狹縫之間的距離、單色器的性能、狹縫幾何形狀等),不同的儀器類型很可能會為相同的混濁樣品提供不同的OD 600讀數(shù)。因此,如果要比較不同分光光度計的結(jié)果,則必須首先使用兩種不同儀器上的相同樣本進行OD600值比較,并進行相關(guān)性的歸一化。


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    OD600校正值公式


        NanoPhotometer?或OD600 DiluPhotometer?等儀器默認(rèn)“校正系數(shù)”為1,如使用相應(yīng)方法進行調(diào)整,將有助于在不同設(shè)備之間提供可比較的結(jié)果。


    OD600校正因子= 設(shè)備1測量值 / 設(shè)備2測量值


        或者使用創(chuàng)建適當(dāng)?shù)男?zhǔn)曲線來采用更精確的方法,可以通過在不同濃度范圍內(nèi)比較測量的OD600與預(yù)期的OD600來構(gòu)建校準(zhǔn)曲線。預(yù)期的OD600是通過使用替代技術(shù)(例如顯微鏡載玻片法)進行細(xì)胞計數(shù),并使用經(jīng)驗法則將1個OD600=5×108個cells/ml的大腸桿菌聯(lián)系起來。


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        通常建議使用試管或比色皿進行OD600測量,以確保讀數(shù)的穩(wěn)定性,較大體積樣品提供了更大的濁度平均值,誤差相對較小。此外,為了防止菌體沉降過快,并給出隨時間變化的OD讀數(shù),可向樣品中添加甘油。對于一些很小的樣品量要求,使用微滴進行測量,也是可行的,特別是NanoPhotometer?的樣品壓縮法,在液膜中測量,可避免液柱中顯著的沉降現(xiàn)象。但需注意在上樣前樣品的充分混勻。

     

        用于測量的儀器的線性范圍對于覆蓋培養(yǎng)物的整個生長周期至關(guān)重要,建議至少2.5 OD的OD限值以提供足夠的工作范圍。如果存在大量的死細(xì)胞,使結(jié)果模糊不清,則樣本可能在整個范圍內(nèi)不是線性的。如果樣品仍然超出范圍,則可能需要稀釋;應(yīng)仔細(xì)選擇參數(shù)以覆蓋整個所需區(qū)域,而不影響測量的線性度。


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        為了減少OD600測量所需的體積,并避免耗時且容易出錯的手動稀釋,可以使用特殊的比色皿。Implen的DiluCell?自動稀釋比色皿可降低樣品體積要求,并提供自動虛擬樣品稀釋。由于DiluCell?的獨特設(shè)計,光路從標(biāo)準(zhǔn)的10毫米減少到1毫米(DC 10)。根據(jù)朗伯-比爾定律,光程因子為10。使用DiluCell?自動稀釋可節(jié)省時間,并排除稀釋誤差和交叉污染。


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        德國Implen提供多種OD600測量解決方案,包括應(yīng)用于基礎(chǔ)測量和高級工藝開發(fā)的不同機型,具有可靠的測量結(jié)果和豐富的軟件功能,以及合規(guī)性功能,能夠充分滿足不同用戶的需求。OD600測量,認(rèn)準(zhǔn)德國Implen。


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