01

OD600的應(yīng)用--幫助了解細(xì)菌的生長狀態(tài)

OD600是指在600nm波長處的吸光值，常常被用于分析細(xì)菌生長和進(jìn)行抗生素敏感性測試，在細(xì)菌檢測中，測量波長需要選擇在生物材料吸光度最小的范圍內(nèi)。因此，這些細(xì)菌生長曲線測量通常使用600-670nm左右的紅色波長。在細(xì)菌連續(xù)培養(yǎng)過程中，在不同的時間點檢測菌液的OD600值，然后以時間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)，描繪細(xì)菌的生長曲線。結(jié)合生長曲線，可以評估細(xì)菌所處的生長階段，進(jìn)而可以確定合適的誘導(dǎo)表達(dá)或收獲的時間點。

02

OD600 測量菌液/細(xì)胞濃度的原理

細(xì)菌密度的測量方式是通過光的散射，也就是看渾濁程度而不是吸光度，光的散射程度反應(yīng)的是細(xì)胞的生物質(zhì)量而不是細(xì)胞個數(shù)，也稱濁度測量。濁度法測量非均質(zhì)溶液中是否存在固體顆粒。固體顆?？梢允羌?xì)胞、沉淀、聚集體或溶液中存在的任何其他固體物質(zhì)。顆粒會散射光束中的光子，因此儀器檢測器會檢測到較低的光強度。這種現(xiàn)象與吸光度測量截然不同，吸光度測量是指光子被均勻溶液中的特定染料吸收，吸光度和濁度散射的基本區(qū)別如圖 1 所示。

圖1：吸光度和濁度散射的基本區(qū)別, 在吸光度測定中，由于光被樣品吸收，光電探測器中的光強會減弱（A）；在濁度測定中，入射光由樣本中的細(xì)胞/粒子隨機產(chǎn)生散射。這將導(dǎo)致方向的不確定性。繼續(xù)沿直線傳播的光會進(jìn)入檢測器，光強也會減弱（B）

03

使用不同的設(shè)備測量OD600細(xì)菌濃度可能得到不同的數(shù)值

對于具有濁度的樣品，如細(xì)菌溶液、細(xì)胞培養(yǎng)物，測量的“吸光值”是由于光散射，而不是溶質(zhì)分子光吸收的結(jié)果。由于光散射的程度受系統(tǒng)光學(xué)特性(比色池和儀器出口狹縫之間的距離、單色器光學(xué)特性、狹縫幾何特性等)的影響，使用不同類型的分光光度計測量同一樣品時，可能會得到不同的OD600讀數(shù)。

那我們來看下主要有哪些原因影響濁度的測量呢？

一是濁度測量受樣品中顆粒濃度的影響

濁度測量總是在異質(zhì)樣品中進(jìn)行，一般需要測量96/ 384 孔板，現(xiàn)在多數(shù)酶標(biāo)儀通常使用相當(dāng)窄的測量光束。通常情況下，微孔板光度計的光束直徑不到一毫米，當(dāng)光束穿過96孔板的孔時，測量光束只能覆蓋樣品體積的很小一部分（圖2）。另外，現(xiàn)代微孔板光度計的采樣時間也很短，通常為毫秒級，這些對于濁度測量來說并不是最佳選擇會增加變化。比如液體中的固體顆粒并非處于靜止?fàn)顟B(tài)，而是在整個液體中自由漂浮。因此，當(dāng)樣品中只有少量固體顆粒時，在重復(fù)測量中，相同數(shù)量的顆粒出現(xiàn)在光束內(nèi)的概率很低。如果樣品中有100 個顆粒，那么測量光束區(qū)域內(nèi)的顆粒數(shù)最有可能是1個，但隨機情況下可能是0個或2個，甚至3個。當(dāng)采樣時間也以毫秒為單位時，液體中顆粒的動態(tài)流動不會明顯改變單個測量中的這種情況。因此,當(dāng)OD值較低時，檢測精度可能會明顯降低，吸光度檢測的 CVs% 也會大于正常值。

同樣，當(dāng)樣品中的顆粒數(shù)量增加到非常多時，從顆粒上散射的光子會撞擊到另一個顆粒并重新散射。這將導(dǎo)致一些散射光子經(jīng)過多次散射后到達(dá)檢測器。因此，濁度測量的線性測量范圍總是低于吸光度測量。

二是不同儀器分光光度計的設(shè)計影響濁度測量

吸光度和濁度測量之間第二個非常重要的區(qū)別是，不同儀器的光學(xué)設(shè)計會影響所得到的OD值（圖 3）。因此，不同廠家生產(chǎn)的微孔板光度計沒法對同一樣品給出相同的OD值。這里有兩個影響因素：一是光電探測器收集窗口的大小，二是收集狹縫的大小。探測器窗口越大，收集到的輕微散射光子就越多，因此觀測到的OD 值就越低。還有一個主要問題是樣品到檢測器的距離。如果檢測器距離樣品很遠(yuǎn)，即使是輕微散射光子也會到達(dá)檢測器；如果很近，即使是強烈散射光子也會被檢測器收集到。因此，這個距離對得出的OD 值影響也很大。由于每個制造商的光學(xué)設(shè)計不同，這兩個參數(shù)（距離和探測器的大小）在兩臺不同的儀器中永遠(yuǎn)不會相同。這些因素不會影響吸收測定，因為在吸收測定中光束形狀保持不變。檢測器的大小或距離不會改變到達(dá)檢測器的光量。

圖示3：檢測器收集窗口的大小和與樣品的距離都會改變所測得的OD值，因此不同的儀器會對相同的樣品給出不同的OD值。檢測到的OD值差異很容易達(dá)到20-40%。

比如下圖中，在濁度測定結(jié)果的偏差表明，Multiskan Sky 和 SkyHigh 采用了非常相似的光學(xué)設(shè)計，因此結(jié)果幾乎相同，但Varioskan LUX 和 Multiskan FC 采用了不同類型的光學(xué)器件，因此與Sky和SkyHigh有很大不同，兩者之間也存在明顯差異。但在吸光度測量方面，所有四款酶標(biāo)儀的測量結(jié)果完全相同。

圖示4：不同型號酶標(biāo)儀檢測吸光度和濁度的比較

因此，對于OD600測量，不同酶標(biāo)儀的結(jié)果不能直接進(jìn)行比較。對于OD600測量，使用相同型號的分光光度計可以保障良好的重復(fù)結(jié)果。而對于不同酶標(biāo)儀的結(jié)果首先需要使用適當(dāng)?shù)男?zhǔn)曲線進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

常規(guī)的酶標(biāo)儀檢測都具備了光吸收檢測功能，賽默飛多款酶標(biāo)儀具有單獨模塊用于濁度檢測，比如單功能酶標(biāo)儀FC，配有比色杯模塊的Multiskan SkyHigh 以及多功能酶標(biāo)儀Varioskan LUX等，都是核酸、蛋白質(zhì)、菌液濃度及其他物質(zhì)測量的多功能儀器，可為用戶提供完善的解決方案。